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献给初学者:手把手教你做细胞计数实验
2016-08-24 | 作者: 生物360 | 来源: 生物360 | 点击率: 【小  大】【打印】【关闭】
  今天我们就来聊一聊细胞计数实验。

  

  实验用品 
   
  0.4% 台盼蓝溶液、无水乙醇或 95% 乙醇溶液、脱脂棉、普通显微镜、试管、吸管、毛细吸管、细胞计数板、绸布。
   
  实验原理
   
  在细胞培养工作中,常需要了解细胞生活状态和鉴别细胞死活,确定细胞接种浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度,如用酶消化制备的细胞悬液中细胞活力的鉴别,冻存细胞复苏后的活力检测等。
   
  细胞悬液制备后,常用活体染料台盼蓝对细胞进行染色,进行细胞计数。台盼蓝不能透过活细胞正常完整的细胞膜,故活细胞不着色。而死亡细胞的细胞膜通透性增高,可使染料进入细胞内而使细胞着色(蓝色)。
   
  细胞计数一般用血细胞计数板,按白细胞计数方法进行计数,便于确定细胞的生活状况。
   
  实验内容与方法
   
  1. 制备动物细胞悬液 
   
  将动物细胞用生物盐水制备成适当浓度的细胞悬液备用。
   
  2. 细胞计数 
   
  (1)计数板处理
   
  用无水乙醇或 95% 乙醇溶液擦拭计数板后,用绸布擦净,另擦净盖玻片一张,把盖片覆在计数板上面。
   
  (2)染色 
   
  用滴管吸取 0.4% 台盼蓝染液,按 1∶1 比例加入细胞悬液中。从计数板边缘缓缓滴入,使之充满计数板和盖片之间的空隙中。注意不要使液体流到旁边的凹槽中或带有气泡,否则要重做。稍候片刻,将计数板放在低倍镜下(10×10 倍)观察计数。
   
  (3)计数方法 
   
  按图计算计数板的四角大方格(每个大方格又分 16 个小方格)内的细胞数。计数时,只计数完整的细胞,若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。在一个大方格中,如果有细胞位于线上,一般计下线细胞不计上线细胞,计左线细胞不计右线细胞。二次重复计数误差不应超过 ±5%(图 7-1)。镜下观察,凡折光性强而不着色者为活细胞,染上蓝色者为死细胞。
   

  

   
  (4)计数的换算 
   
  计完数后,需换算出每 ml 悬液中的细胞数。由于计数板中每一方格的面积为 0.01 cm2,高为 0.01 cm,这样它的体积为 0.0001 cm3,即 0.1 mm3。由于 1 ml = 1 000 mm3,所以每一大方格内细胞数×10 000 = 细胞数 /ml,故可按下式计算:
   
  细胞悬液细胞数 /mL = 4 个大格细胞总数 /4×10 000。
   
  如计数前已稀释,可再乘稀释倍数。
   
  计数细胞后,计算细胞悬液浓度并求出存活与死亡细胞数的比例。
   
  注意事项
   
  向计数板中滴细胞悬液时要干净利落,加量要适当,过多易使盖片漂移,或淹过盖片则失败,需重做,过少易出现气泡。不理想时,应重做。
   
  镜下计数时,若方格中细胞分布明显不均,说明细胞悬液混合不均匀,需重新将细胞悬液进行混合,再重新计数。
   
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