理想情况下，可接受的麻醉方法应最大程度减少对动物的潜在疼痛和应激、保护操作人员的安全、给药简单、尽可能减少记录保存和处置要求、大批量安乐死动物的成本效益，并能够确保动物尸体适合其他用途，如用于研究或作为捕食啮齿类的动物的食物。

　　虽然使用100% CO2的每分钟置换率 (VDR/min) 满足多数上述要求，但为尽可能减少动物安乐死过程中所经历的潜在疼痛（VDR/min大于70%时）或应激（VDR/min小于30%时），推荐使用的VDR/min在30%-70%之间。

　　理想的安乐死方法的关键特征之一是（死亡的）不可逆性。当使用吸入麻醉剂时，在麻醉气体中的暴露时间对于确保达到 IV 期麻醉（呼吸停止）至关重要。由于小型啮齿类动物在实施CO2或卤化麻醉剂安乐死后，可能发生生命复苏的情况，因此通常建议在处置尸体前采用第二种安乐死方法（例如，颈椎脱臼、断头、开胸或放血）。

　　对从事这项工作的人来说，这些物理安乐死方法可能会给他们带来情绪上的负担。因此，在使用吸入麻醉剂进行大小鼠安乐死时，确保安乐死的不可逆性将有助于减少操作人员的同情心疲劳。

　　最短暴露时间

　　本研究评价了成年大小鼠暴露于CO2后的苏醒情况，以确定不可逆的CO2安乐死的最短暴露时间。本文编译了该文献的动物选择、结果和讨论部分（具体的试验设计细节请查阅参考文献）。

　　动物选择

　　小鼠：522只雌性或者雄性小鼠，来源于41个品系（年龄：22~274日龄，平均200日龄）

　　大鼠：1224只雌性或者雄性大鼠，来源于14个品系（年龄：25~519日龄，平均167日龄）

　　结果

　　对于小鼠，在100% CO2中主动暴露（active exposure）2min后，再进行3 min 的最小被动暴露（passive exposure）时间，才可以确保不可逆的安乐死（联合暴露时间总计 5 min）。在被动暴露的3-4 min时间操作范围内，无小鼠苏醒（表 1）。

　　表 1. 暴露于 100% CO2 2 min 后恢复的小鼠数量和百分比

　　对于大鼠，在100% CO2中主动暴露（active exposure）2min后，则需继续进行10.5 min 的最小被动暴露（passive exposure）时间，才可以确保不可逆的安乐死（联合暴露总计 12.5 min）。在 10.5 ~ 11.5 min 的被动暴露时间操作范围内，无大鼠苏醒（表 2）。

　　表 2. 暴露于 100% CO2 2 min 后恢复的大鼠数量和百分比

　　讨论

　　确保所选择的安乐死方法的不可逆性是安乐死操作的关键组成部分。当使用吸入性麻醉剂进行过量麻醉实施安乐死时，通常建议采用第二种物理安乐死方法确保动物死亡。多数情况下，因研究要需，在动物安乐死后需进行组织采集，通常可以实施二次安乐死。如果不需要组织样本采集，则无需实施第二种物理安乐死方法，以最大限度地减少操作人员的同情心疲劳。 

　　本研究表明，在制定安乐死指导原则时，大鼠和小鼠之间存在显著差异。尽管至少 3 min 的被动暴露时间足以确保成年小鼠发生不可逆的死亡，但如果未进行物理人道处死方法，成年大鼠极有可能从该暴露持续时间中苏醒。为确保单独使用CO2安乐死的大鼠发生不可逆死亡，必须在CO2中将被动暴露时间至少延长到10.5 min。

　　总之，本研究表明，通过延长大鼠和小鼠的CO2暴露时间可实现不可逆死亡。

　　参考文献：

　　Debra L Hickman, Minimal Exposure Times for Irreversible Euthanasia with Carbon Dioxide in Mice and Rats, Journal of AALAS, 2022