摘要：背景：越来越清楚的是，除了髓鞘破坏，轴突变性也可能是多发性硬化症（MS）的一个关键病理学。因此，轴突变性机理的阐明不仅能帮助我们理解整个MS病理学，还能阐明额外的治疗目标。本研究的目的是评估EAE小鼠轴突膜破裂的程度及其在运动障碍中的意义。

方法：皮下注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白/完全弗氏佐剂乳化剂，随后腹腔注射百日咳毒素诱导小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎。行为评估是采用5点量表进行。。用辣根过氧化物酶排除试验定量检测轴突膜的破坏情况。在磷酸盐缓冲盐水中制备聚乙二醇30%（w／V）溶液，腹腔注射。

结果：我们已经发现当症状达到高峰，及较小程度上在症状前阶段的EAE小鼠上出现轴突膜破裂的证据。此外，聚乙二醇（PEG），一种已知的膜融合剂，显著降低EAE小鼠轴突膜破裂。PEG介导的膜修复伴随着行为缺陷的显著改善，包括出现运动障碍的延迟，出现峰值症状的延迟，以及峰值症状严重程度的降低。

结论：目前的研究首次表明轴突膜断裂可能是EAE小鼠病理学的重要组成部分，可能是行为缺陷的基础。研究也表明，PEG作为治疗剂可以修复损伤，逮捕轴突变性和降低EAE小鼠运动障碍。

关键词：多发性硬化症  EAE  轴突膜损伤  聚乙二醇  丙烯醛  辣根过氧化物酶 膜通透性   神经退行性疾病

背景：虽然炎症是多发性硬化（MS）的主要病理机制，但组织损伤和功能丧失的机制仍不清楚。而髓鞘变性一直被认为是MS的主要病理特征，最近的研究表明，轴索变性也是病理学的一个重要组成部分。事实上，有强有力的证据表明MS是一种神经退行性疾病。事实上，轴突和髓鞘的完整性对神经细胞功能和生存是必不可少的。因此，髓鞘或轴突损伤可能在理论上导致轴突传导功能丧失和变性。有人认为轴突破裂可能是MS患者不可逆转的神经退行性变。这可能部分地解释了为什么传统的只注重髓鞘保护的策略导致了一些有效的治疗来减缓或阻止MS的进展。尽管其在MS中具有潜在的重要性，但轴突损伤与髓鞘损伤相比，却没有引起注意，而这两种损伤都能导致MS的神经退行性变。因此，轴突损伤在MS中的病理作用仍然没有足够的特征。具体来说，触发轴突变性的关键细胞过程仍不清楚。我们先前已经证实轴突膜损伤可导致中枢神经系统损伤的轴突变性。我们还发现丙烯醛是一种促炎症醛，能引起轴突膜损伤和功能丧失。可能在MS中起重要的病理作用。鉴于这方面的证据，我们推测，损伤的轴突膜或膜，可能导致神经元变性和神经功能的丧失，因此有助于观察MS症状的发生发展。聚乙二醇（PEG）是一种亲水性聚合物，它能密封神经元膜，从而恢复完整性和相关的神经元功能。PEG能够修复损伤和能够提供在外伤性脊髓损伤的保护作用。，在非创伤性中枢神经系统疾病如MS中，PEG的治疗效果尚未被研究，其中轴突膜损伤可能导致轴突变性。我们的目的是确定在MS能够破坏病理作用和评价给予聚乙二醇作为膜密封剂的疗效。

方法：实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠：雌性C57BL / 6小鼠，十至十二周龄，接受0.1 毫升髓鞘少突胶质细胞糖蛋白/完全弗氏佐剂乳化剂上下背部皮下注射。22-26h后百日咳毒素腹腔注射。行为评估是采用5点量表进行。动物被放置在金属格栅上记录它们的行走能力和运动功能。行为量表如下：0-没有缺陷；1-卷尾；2-后肢麻痹没有拖腿；3-部分后肢无力与一个或两个腿拖；4-完整的后肢瘫痪；5-奄奄一息，后肢和前肢瘫痪。

辣根过氧化物酶排除试验：将小鼠分为4组：健康对照组、EAE小鼠在发病前（症状前）、EAE小鼠的峰值行为缺陷（峰值症状）和PEG处理的EAE小鼠。在确定不同实验终点后的行为确认后。每一组动物氯胺酮（90 毫克/公斤）和甲苯噻嗪（10 毫克/公斤）麻醉后，灌注冷的含氧的Krebs溶液。迅速切除脊柱，并完成全椎板切除术。然后从脊椎切除脊髓和放置在含有0.015%的辣根过氧化物酶冷的Krebs溶液2 h。室温组织固定于2.5%戊二醛磷酸缓冲液中4 h。固定后，切割30 μm厚的切片。用光学显微镜连接到计算机上获得HRP染色脊髓切片的数字图像。用图像J分析染色轴突的计数和表达。处死动物进行结构分析，在诱导前（对照组），诱导后8 天（前期症状），或诱导后4 周（峰值的症状）。

聚乙二醇处理：在磷酸盐缓冲盐水中制备聚乙二醇30%（w／v）溶液。将溶液过滤消毒每天注射到整个研究诱导4 周后的每个动物。每日腹腔注射0.1ml。EAE鼠给予等量的生理盐水而不是PEG。

结果：EAE小鼠轴突细胞膜损伤及使用聚乙二醇损伤减少：使用EAE小鼠模型，我们首先检查轴突膜损伤的一个行之有效的辣根过氧化物酶排除试验。对照组小鼠脊髓的轴突膜完整性，EAE小鼠在症状出现前（症状前）和EAE小鼠的峰值行为缺陷（峰值症状）。在这些条件下平均HRP标记分别为811±130轴突/平方毫米，3293±500轴突/平方毫米，和6147±655轴突/平方毫米。与对照组相比，峰值行为缺陷的EAE小鼠表现出更高水平的HRP标记。与对照组相比，症状前EAE小鼠也显示轴突膜通透性增加。我们进一步研究了PEG能降低轴突膜通透性的可能性。EAE小鼠分别给予0.1 毫升聚乙二醇每天注射（30% w/v）（EAE+PEG），或生理盐水（只EAE）从诱导后第一天开始，连续4 星期。在治疗结束时进行了基于HRP排斥试验的轴突完整性分析。我们发现，在EAE+PEG组HRP标记的轴突密度为1581±247轴突/平方毫米，这是显著低于EAE小鼠组。

聚乙二醇暂时改善EAE小鼠运动障碍：除了轴突膜透性测试，我们也进行了EAE和EAE+PEG两实验组小鼠行为分析。每天记录每个动物的行为，连续4 周。计算两组平均每天的行为评分，并随时间推移显示。在EAE诱导后16天到25天，EAE /聚乙二醇组行为缺损程度明显低于EAE模型组。PEG处理还显著延迟达峰时间。除了降低峰症状严重程度和延迟到达峰值症状外，PEG处理的动物也表现出延迟症状的发作。特别是在EAE组，所有小鼠在诱导后13到18天之间开始表现出行为缺陷。与此相反，EAE+PEG组揭示了一个更为分散的结果与延迟性趋势。5只EAE+PEG动物同EAE组有大约相同的发作时间（诱导后13-18天）而其他动物都在后来的时间。3只在整个观察期为出现行为缺陷被排除，其余动物在诱导后20-26天出现行为缺陷。总的来说，EAE+PEG组平均发病时间明显滞于EAE组。

结论：我们的研究结果表明除了髓鞘破坏外，还有明显的轴突膜损伤。可能有助于EAE小鼠的神经退行性疾病研究。此外，轴突和髓鞘的损伤可能需要不同的保护措施，两者都是神经元功能正常化的关键。总之，PEG介导的膜修复策略可能需要与其他旨在保护和修复髓鞘的措施相结合为了最大限度地提高MS的治疗效果和最终功能的保护和恢复。