Cas13a结合和切割单链RNA。图片来自Stephen Dixon。

 

早在2016年，科学家们就发现了结合和切割单链RNA而不是DNA的CRISPR蛋白（Science, doi:10.1126/science.aaf5573）。如今，在一项新的研究中，来自美国麻省理工学院（MIT）的研究人员对这种被称作CRISPR-Cas13a的系统进行调整，使之在哺乳动物细胞中发挥作用。相关研究结果于2017年10月4日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“RNA targeting with CRISPR–Cas13”。

 

在美国罗彻斯特大学开展RNA靶向CRISPR系统研究的Mitchell O’Connell注意到，“在CRISPR之前，RNAi（RNA干扰）是调节基因表达的理想方法。但是Cas13a的重大益处之一是它似乎具有更强的特异性，而且这种系统对哺乳动物细胞而言并不是内源性的，因此你不太可能扰乱细胞中天然的转录后网络。相反，RNAi利用内源性机制开展基因敲降（gene knockdown，即抑制基因表达）。”

 

在这项新的研究中，来自MIT的张峰（Feng Zhang，音译）教授和他的同事们证实切割RNA的Cas13a酶（之前称作C2c2）能够特异性地降低哺乳动物细胞中的内源性RNA和报告RNA水平。 这些研究人员已从多种细菌物种中寻找一种能够切割大肠杆菌报告基因的Cas13a酶。张峰教授和他的同事们着重关注来自细菌Leptotrichia wadei的Cas13a酶，这是因为经证实它最为高效地切割它的RNA靶标。

 

他们随后构造出一种双质粒RNA靶向CRISPR系统，该系统在不同的质粒上表达向导RNA（gRNA）和Cas13a基因，其中Cas13a基因含有一种经过改造的核定位序列（nuclear localization sequence）。在人细胞系中，这种CRISPR-Cas13a构造物高效地切割报告质粒（reporter plasmid）中转录的RNA和三种内源性基因转录的RNA。

 

这种RNA靶向系统能够类似地抑制体外培养的源自水稻（Oryza sativa）的原生质体（移除细胞壁的细胞）中的内源性基因。

 

O’Connell注意到，“RNAi和Cas13a的效率是相类似的，但在某些情形下，Cas13a具有更好的效率。这是一个良好的开端。考虑到这些研究人员观察到依赖于选择的靶位点，Cas13a的靶向活性发生很大变化，我们仍然需要更多地考虑如何选择最佳的靶位点以便实现最优的Cas13a活性。”

 

美国哈佛大学化学生物学教授David Liu（未参与这项研究）在发送给《科学家》杂志的电子邮件中写道，“这是一项很好的研究。它证实Cas13a系统的可编程的RNA靶向能力能够被用来抑制细胞RNA靶标、结合和富集感兴趣的RNA，并且通过序列特异性的结合对细胞内的RNA进行成像。这种RNA靶向CRISPR系统具有一系列不错的潜在有用的应用。”

 

鉴于张峰教授和他的同事们最初已在细菌中证实在切割它的靶序列之后，Cas13a作为一种非特异性的RNA切割酶发挥作用，在它的途中切割RNA，如今，他们解决了Cas13a的这种相同的性质是否也存在于哺乳动物细胞中。利用RNA测序，他们证实与在细菌中不同的是，在人细胞系中，Cas13a仅靶向gRNA指定的RNA，而让细胞中测序的所有其他的RNA保持完整。

 

O’Connell说，“这是一项非常令人惊讶的结果--- Cas13a的非特异性RNA切割功能并未发挥作用。这有点让人困惑，一个价值连城的问题是为何这样？”

 

张峰教授实验室研究生Omar Abudayyeh（与也来自张峰教授实验室的研究生Jonathan Gootenberg同为论文第一作者）对此表示赞同。“这项研究的令人吃惊之处在于我们并没有在哺乳动物细胞或植物细胞中检测到Cas13a活性发生变化。”

 

这些研究人员构建出一种缺失核酸内切酶活性Cas13a版本，它能够结合到序列特异性的单链RNA上，但不会对其进行切割。利用偶联到一种荧光蛋白的Cas13a酶版本，他们能够在细胞中追踪Cas13a结合的RNA从细胞核迁移到细胞质中。

 

科学家们之前已对Cas9（一种结合和切割DNA的CRISPR蛋白）进行调整来靶向RNA（Cell, doi:10.1016/j.cell.2017.07.010）。根据O’Connell的说法，是利用Cas9还是利用Cas13a靶向RNA更有优势，还仍有观察。

 

Gootenberg说，“鉴于我们已证实Cas13a能够在哺乳动物细胞中结合和特异性地切割RNA，我们能够想象，它进一步在剪接、测量RNA结合蛋白如何与RNA相互作用等方面具有一系列应用。”