摘要：氨甲蝶呤（MTX）是治疗类风湿关节炎（RA）最常用的药物之一，最近的研究也表明该药物对治疗膝关节骨性关节炎有潜在益处。氨甲喋呤通常口服给药，但常导致全身不良反应。先前已经表明，透明质酸（HA）和MTX的结合物具有潜在的作为关节炎关节炎治疗的候选药物。在这项研究中，我们比较优化的DK226（HA-MTX结合物）与MTX治疗大鼠炎症性关节炎模型的疗效和安全性。

方法：用人类成纤维细胞样滑膜细胞（HFLS）和滑膜肉瘤细胞系SW982评价DK226体外活性。兔滑膜组织匀浆或滑液孵育后研究DK226释放的 MTX。大鼠膝关节用抗原诱导关节炎（AIA）和胶原诱导性关节炎（CIA）两种方法评价DK226的疗效。AIA模型口服MTX或关节内注射DK226后评估其药动学和血液学毒性。

结果：DK226抑制HFLS和SW982活性。过量的HA和CD44单克隆抗体能逆转抑制活性。DK226释放MTX与兔滑膜组织匀浆或滑膜液在pH  4孵化。关节内注射DK226能显著改善AIA，但是HA和口服MTX不能改善。口服MTX诱导血液学毒性，而DK226没有。口服MTX后血浆最大MTX浓度比DK226关节内注射后产生的MTX浓度高40倍。关节腔内注射DK226抑制能AIA的膝盖肿胀。DK226注入右膝关节明显减少CIA的肿胀和治疗膝关节滑膜炎症，对未处理的对侧膝关节无影响。

结论：在两种不同的关节炎模型中，DK226发挥抗关节炎作用。该结合合物比口服MTX具有更宽的治疗面，有望成为治疗关节炎，包括炎症性骨关节炎的未来药物。

关键词：透明质酸  氨甲喋呤  化学共轭   类风湿性关节炎   骨关节炎  关节内注射  抗原诱导的关节炎  胶原诱导的关节炎

背景：类风湿关节炎（RA）和骨关节炎（OA）是最常见的慢性炎症性关节疾病。最近的证据表明，滑膜炎症也与OA的许多症状和体征有关，包括疼痛、关节肿胀和积液。滑膜炎与类风湿关节炎相似，但炎症的强度和性质不同于OA和RA。关节炎是控制关节症状的一个潜在靶点。氨甲喋呤（MTX）是一种最常用的抗风湿药物，被认为是通过抗炎机制发挥作用的。MTX也减轻疼痛和炎症在膝关节骨性关节炎，MTX已被建议作为OA治疗的一种新治疗方案。虽然MTX广泛应用于类风湿性关节炎的治疗，氨甲喋呤副作用有如肺炎、肝纤维化，骨髓抑制等。一般停用MTX的主要原因不是缺乏疗效，而是其副作用。关节内给药可用于治疗关节炎时，少数关节受到影响。关节内给药有药物靶向作用部位的优点，从而避免全身性副作用。但结果并不令人满意，因为关节内给药的药物迅速从关节腔消失。迄今为止，已经报道了各种用于甲氨蝶呤的关节内给药系统，包括脂质体、微球和水凝胶。尽管有一些有希望的临床前结果，但迄今为止没有一种被应用于关节炎患者的治疗。可能是由于关节内给药系统常见的问题，如生物相容性，耐受性，安全性，有效性和制造技术。关节内透明质酸是广泛使用的透明质酸或改善膝关节骨关节炎症状。HA制剂逆转了引起关节疼痛的病理状态的关节滑液受损的粘性和弹性，从而消除疼痛。我们正在调查HA作为载体的使用，它将增加MTX在受影响关节的停留时间。HA - MTX结合物将是这两种临床有效药物的合理组合，因为在该结合物中，它们各自保留各自的生物活性。在本研究中，我们进一步评估DK226其作用机制、药代动力学（PK）的性能，并在两个不同的关节炎大鼠模型AIA和CIA进行初步安全性和疗效评价。

方法：动物：10周龄雌雄 DA/SIC大鼠，11周龄雄性JW兔，5周龄的雄性LEW / CRJ大鼠。

兔滑膜组织匀浆或滑液孵育后MTX释放：12周龄的雄性大白兔部分半月板切除，术后8, 11, 15、18, 25、29天从兔膝关节处采集滑膜液。并存储在?80°C直到使用。术后29天处死动物，在乙醚麻醉下放血，解剖滑膜组织并称重，在4倍体积的0.05 mol/L Tris-HCL中匀浆。匀浆物存储在?80°C直到使用。用酶联免疫吸附法测定滑膜组织匀浆和关节液的蛋白质含量。在37°C，40 μg/mL DK226 或10 μg/mL MTX-α-Phe在0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH 4）或0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中同有或无滑膜组织匀浆或滑液（500μg蛋白/ ml）孵育3, 8，和24h。每次孵育结束时，收集100ul的反应混合物，并与1毫升乙醇混合制备MTX.

AIA的诱导与治疗: 免疫6周龄的雄性LEW / CRJ大鼠. 关节炎诱导日（第0天），一个50μl改良牛血清白蛋白水溶液（mBSA）（2毫克/毫升）右膝关节单关节内注射治疗。左膝关节未作处理，作为对照组。诱导关节炎前7天，口服MTX，剂量为1.25毫克/公斤，一周五次。在诱导关节炎前7天、 前一天和诱导关节炎后第7天和14天，DK226或赋形剂（磷酸盐缓冲液，PBS）右膝关节内注射等剂量50μL（0.5毫克HA，30 nmol MTX）。在另一项实验中，在关节炎诱导前7天、前1天和诱导后7天，右膝关节给予HA（0.5毫克），游离MTX（25 nmol/L），HA（0.5毫克）和氨甲蝶呤（25 nmol/L）混合物，或DK226（0.5毫克HA，25 nmol MTX）。膝关节肿胀如先前描述的那样被评估。

AIA血液毒性的评估：从口服MTX或关节内给予DK226 后14天的24 h内从 AIA大鼠踝静脉收集血液样本，进行血液学分析。测量白细胞、红细胞、血红蛋白、红细胞压积、血小板值。

血浆中氨甲蝶呤的测定：从诱导AIA大鼠的第14天口服MTX后的0 h（前处理）、0.25、0.5、1, 2, 4、8、24 h及注射DK226后的4, 8, 24，48，和72h收集血液样品。采用液相色谱-串联质谱法测定血浆MTX、MTXα- Phe和MTXα- Phe -Phe水平。

CIA的诱导和治疗: 第0天，对十一周龄雌性大鼠/ SLC采用四点皮内注射免疫0.3mg牛II型胶原蛋白与弗氏不完全佐剂等体积乳化物。赋形剂（生理盐水）、HA(0.5mg)、DK226(HA 0.5mg  26nmol MTX)50ul被注射到右膝关节，5天一次，从0天到20天。左膝关节未给药。三只动物未进行免疫接种，作为对照组（正常对照组）。第0, 5, 10、13, 15, 17、20和23天用卡尺测量每个膝关节的宽度来评估膝关节肿胀度。第23天，麻醉状态下放血处死动物，取右膝关节进行组织学评价。

组织学评价：CIA大鼠右膝关节在室温下用20%中性缓冲福尔马林固定过夜。样品脱水，石蜡包埋，在正中矢状面检查滑膜和在纵向平面检查股骨外侧髁。3微米厚的切片用HE染色或是番红染色，根据以下半定量分级：0=无病理变化；1=最小（最小的变化，或病变累及<整个25%节）；2=（明显轻微变化，或影响25-50%的病变）；3=适中（相对的剧烈变化，或病变累及50-75%）；4=严重（严重的变化，或影响>整个截面的75%病变）。关节腔渗出、纤维化、肉芽组织形成、滑膜细胞增生、炎性细胞浸润、水肿。股骨外侧髁的评估通过番红O染色，骨赘形成减少，软骨破坏，骨皮质破坏和血管翳形成。

结果：滑膜细胞的抗增殖作用：为了验证DK226生物活性和确认结合物是否与HA受体结合，我们研究了DK226对有或无外源性HA或抗CD44抗体滑膜细胞增殖。DK226对肿瘤坏死因子-α诱导的HFLS细胞增殖有明显的抑制作用，但HA（高达1毫克/毫升）没有，且呈剂量依赖性。然而， DK226的抑制作用（0.1毫克/毫升）能通过外源性HA逆转（1毫克/毫升）。这意味着HA的受体如CD44参与DK226诱导的抗增殖过程。对DK226的抑制作用是通过加入抗CD44抗体，但抗CD44抗体本身刺激TNF-α诱导的HFLS细胞增殖。为了解决这个问题，我们采用了滑膜细胞株SW982，其中，抗CD44抗体对细胞增殖无影响。DK226对SW982细胞增殖也以剂量依赖的方式抑制，对DK226效力同游离MTX相媲美。DK226的抑制作用（0.1和0.01毫克/毫升）可通过在SW982加入抗CD44抗体逆转。

从DK226 释放MTX：在DK226，MTX结合HA主要通过肽（α- Phe Phe）和烷基链。MTXα肽通过组织蛋白酶在酸性pH条件下容易切割释放MTX。由于组织蛋白酶是在滑膜组织及滑液中大量表达，我们预计MTX能从DK226中释放。为了检验这种可能性，DK226与滑膜组织匀浆或滑液的兔膝关节OA模型培养。MTX是由滑膜或关节液在pH 4时从DK226释放，但pH值7.4时不释放。在PH值为4时，在培养液中检测MTX-α肽，但单独在缓冲液（PH值4或pH 7.4）孵育时，均未发现MTX和MTXα肽。

AIA模型DK226的疗效和安全性：每周关节内注射DK226显著减少膝关节肿胀。但是HA仅在第7天时有轻微影响。DK226疗效相当，口服MTX。比较DK226和口服MTX治疗的安全，在口服MTX治疗后24小时或DK226治疗14天，我们研究了这两种处理对AIA大鼠血液学参数的影响。口服MTX降低白细胞，红细胞，血红蛋白和红细胞压积值，增加血小板，但DK226没有显示出任何血液学异常。口服MTX后，血浆MTX浓度在0.9小时达到高峰，达到72600微克/毫升，并在24小时内恢复到控制水平。DK226治疗组动物，在注射后20～24小时，血浆MTX逐渐升高到1900微克/毫升水平。在血浆中保持低浓度保持长达72小时。AIA大鼠DK226治疗后显示膝关节肿胀显著减少。相反，游离MTX，游离HA，或HA和MTX的混合物对关节肿胀没有或几乎没有影响。

CIA的抑制作用：从0天到23天，大鼠右膝关节注射DK226表现出肿胀显著减少，但不影响未注射侧左膝关节。大鼠注射HA对左、右膝盖肿胀没有显著影响。右膝盖的关节组织病理学检查显示DK226注射后，减少预防或改善水肿，炎性细胞浸润，滑膜细胞增生，关节软骨侵蚀。相比之下，赋形剂组或HA很少或根本没有影响这些关节炎的变化。相比于HA治疗组，DK226治疗组显著减少滑膜纤维化、肉芽组织形成、炎症细胞浸润和水肿，减少骨赘形成，骨皮质破坏，股骨外侧髁血管翳的形成。

结论：DK226是一种有抗炎功效的新型高分子量HA产品。DK226可以发挥MTX和HA两共轭剂作用，这两种药物均用来治疗关节炎。这可能是治疗包括炎症性关节炎在内的关节炎疾病的一种新方法。